[色譜柱的使用]實驗結果不重現該怎么辦？

在日常檢測或方法轉移過程中，新色譜柱無法重現舊柱的方法，或者不同時間測試結果不重現，是困擾分析人員的常見問題之一，具體是什么原因導致的呢？可以從哪些方面進行排查？

本文將結合兩個實際案例為大家說明。

實例分享一

客戶開發的分析方法，轉移到新site后發現新購買的同一批次3根CORTECS C18新柱都無法重現原方法，但僅第1個化合物峰形較差，其他峰均無問題，這可能是什么原因？見圖一。

圖一

色譜柱返回沃特世實驗室后，首先復核色譜柱柱效，3條色譜柱性能均正常，判斷化合物峰形不佳不是色譜柱的質量問題。然后按照客戶提供的方法重現樣品分析條件，發現與客戶反饋的結果一致，峰1拖尾嚴重。后期我們在原分析方法的基礎上進行了調整，如增加甲酸濃度，使用50 mM甲酸銨（pH不變）等，發現使用緩沖鹽后，峰形明顯改善，但出峰順序改變。見圖二。

圖二

優化后的方法（使用50 mM甲酸銨）在不同色譜柱上的重現結果，見圖三。

圖三

實例分享二

同一支色譜柱同一個樣品，在pH耐受性試驗中發現個別雜質峰保留時間不穩定，隨pH變化而改變，如圖四所示，說明該雜質對pH敏感，為何會出現這種現象？我們應該如何應對？

圖四

我們知道酸/堿性化合物的保留行為受pH影響很大，酸性化合物在低pH的條件下呈分子狀態，保留較好；而堿性化合物在高pH的條件下呈分子狀態，保留較好。而當流動相pH趨于化合物pKa（即非保留平臺區）時，pH變化會嚴重影響化合物的保留行為，如圖五所示。

圖五

在方法開發初期盡量將流動相pH設置在分析物pKa±2以外區域，若無法避開，pH的精準控制將非常重要，建議盡量采用稱重法配制流動相，以保證不同時期配制流動相測試的可重現性。

綜上，當分析方法中使用添加劑或者緩沖鹽的濃度較低時，可能容易出現新柱結果不重現的問題，您可以考慮以下Tips~

Tips

? 增加添加劑或者緩沖鹽濃度，或者使用高濃度緩沖鹽老化新色譜柱后再使用。

? 對pH敏感項目如肽藥，需要對pH精準控制，流動相配制可采用稱重法。

? 方法開發初期盡量多考察不同批次色譜柱，以驗證方法的耐用性。

注：本文分享自【沃特世技術服務】公眾號。

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